Трансформация бактерий как основа генной инженерии и молекулярного клонирования

Скачать

Понятие и задачи генной инженерии и молекулярного клонирования. Характеристика векторов на основе плазмид, бактериофагов и космид. Биотехнологические манипуляции с кишечной палочкой, этапы ее трансформации. Применение трансформированных микроорганизмов.

Размер: 1,5 M
Тип: реферат
Категория: Биология
Скачать

Другие файлы:

Основы генной инженерии и её роль
ДНК - материальная основа наследственности бактерий. Изменчивость бактерий (модификации, мутации, генетические рекомбинации). Генетика вирусов. Механи...

Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование
Монография американских ученых Маниатиса, Фрича и Сэмбрука представляет собой как бы продолжение книги Р. Девиса "Генетика бактерий". Методическое рук...

Генная инженерия
Генная инженерия: история возникновения, общая характеристика, преимущества и недостатки. Знакомство с новейшими методами генной инженерии, их использ...

Биоэтика, ее предмет и основные направления
Характеристика модификации поведения, генной инженерии, суррогатного материнства, клонирования, этики аборта, трансплантации органов, продажи детей, и...

Молекулярно-генетический уровень организации жизни. Генетическая инженерия
Использование клеток, не существовавших в живой природе, в биотехнологических процессах. Выделение генов из клеток, манипуляции с ними, введение в дру...


Краткое сожержание материала:

Размещено на

Министерство образования и науки РФ

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования

ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

РЕФЕРАТ

Трансформация бактерий как основа генной инженерии и молекулярного клонирования

Выполнила студентка 3 курса

Группы Б8308а

Огнева З. В.

Проверила:

Владивосток 2013

Оглавление

Введение

1. Генная инженерия. Молекулярное клонирование

2. Вектор

2.1 Плазмиды

2.2 Бактериофаги

2.3 Космиды

3. Escherichia coli (E. coli) - основная модель биотехнологических манипуляций

4. Основные этапы трансформации E. Coli

5. Практическое применение трансформированных микроорганизмов

Список литературы

Введение

Основой микробиологической, биосинтетической промышленности является бактериальная клетка. Необходимые для промышленного производства клетки подбираются по определённым признакам, самый главный из которых - способность производить, синтезировать, при этом в максимально возможных количествах, определённое соединение - аминокислоту или антибиотик, стероидный гормон или органическую кислоту. Иногда надо иметь микроорганизм, способный, например, использовать в качестве «пищи» нефть или сточные воды и перерабатывать их в биомассу или даже вполне пригодный для кормовых добавок белок. Иногда нужны организмы, способные развиваться при повышенных температурах или в присутствии веществ, безусловно, смертельных для других видов микроорганизмов.

Задача получения таких промышленных штаммов очень важна, для их видоизменения и отбора разработаны многочисленные приёмы активного воздействия на клетку - от обработки сильнодействующими ядами, до радиоактивного облучения. Цель этих приёмов одна - добиться изменения наследственного, генетического аппарата клетки. Их результат - получение многочисленных микробов-мутантов, из сотен и тысяч которых учёные потом стараются отобрать наиболее подходящие для той или иной цели. Создание приёмов химического или радиационного мутагенеза было выдающимся достижением биологии и широко применяется в современной биотехнологии.

Но их возможности ограничиваются природой самих микроорганизмов. Они не способны синтезировать ряд ценных веществ, которые накапливаются в растениях, прежде всего в лекарственных и эфирномасличных. Не могут синтезировать вещества, очень важные для жизнедеятельности животных и человека, ряд ферментов, пептидные гормоны, иммунные белки, интерфероны да и многие более просто устроенные соединения, которые синтезируются в организмах животных и человека. Разумеется, возможности микроорганизмов далеко не исчерпаны. Из всего изобилия микроорганизмов использованного наукой, и особенно промышленностью, лишь ничтожная доля.

1. Генная инженерия. Молекулярное клонирование

Молекулярное клонирование (molecular cloning or gene cloning) - клонирование молекул ДНК (в том числе генов, фрагментов генов, совокупностей генов, ДНК-последовательностей, не содержащих гены), другими словами - наработка большого количества идентичных ДНК-молекул с использованием живых организмов. Благодаря фундаментальным биологическим открытиям XIX-XX-го веков, а именно: открытию клеточного строения тканей, открытию структуры клеточного ядра, хромосом, ДНК, генов, - стало возможным то, что ныне носит название молекулярного клонирования. Это технология клонирования наименьших биологических объектов - молекул ДНК, их частей и даже отдельных генов.

Генетическая инженерия (генная инженерия) - совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы.

Генетическая инженерия не является наукой в широком смысле, но является инструментом биотехнологии, используя методы таких биологических наук, как молекулярная и клеточная биология, цитология, генетика, микробиология, вирусология.

Процессы генной инженерии микроорганизмов и молекулярного клонирования имеют одинаковое начало, но в итоге получается разный результат - в одном случае наработка белка, а в другом - нуклеиновых кислот. Тем не менее, для этих манипуляций необходимо трансформировать бактериальные клетки.

Для получения генно-модифицированного организма, ДНК (обычно тем или иным способом измененную) вводят в вектор (например, в бактериальную плазмиду или геном бактериофага). Размножаясь, бактерии и фаги многократно увеличивают количество введенной ДНК, в точности сохраняя её структуру, следовательно увеличивают количество продуцируемых мРНК и белка. Чтобы затем выделить большое количество продукта необходимо выделение и размножение бактериального или фагового клона, содержащего необходимые молекулы ДНК. Для облегчения селекции бактериальных клонов в плазмиды обычно вводят ген резистентности к антибиотику, чаще всего ампициллину, в присутствии которого погибают все бактерии, не имеющие клонируемой плазмиды. Такое клонирование необходимо для изучения биологических молекул, их идентификации, решения вопросов клонирования тканей и др.

Получение трансгенов стало возможным только после выделения высокоспецифичных бактериальных ферментов, которые узнают определенные последовательности оснований в двухцепочечной молекуле ДНК и расщепляют обе цепи. Эти ферменты называются рестрицирующими эндонуклеазами типа II.

Одна из первых рестрицирующих эндонуклеаз типа II была выделена из бактерии Escherichia coli и получила название EcoR. Этот фермент узнает участок ДНК, содержащий специфическую палиндромную последовательность (последовательность-перевертыш, идентичную в обеих цепях при прочтении в направлении 5'-»3') из шести пар оснований и вносит разрыв между остатками гуанина и аденина в каждой цепи. Разрывы в цепи ДНК располагаются наискось друг от друга, в результате чего образуются одноцепочечные комплементарные концы с «Хвостами» из четырех нуклеотидов в каждом (липкие концы).

Палиндромные последовательности, которые распознаются рестрицирующими эндонуклеазами типа II и в которых происходит расщепление молекулы ДНК, называются сайтами узнавания. Помимо рестриктаз, расщепляющих полинуклеотидную цепь с образованием липких концов, существуют рестриктазы, которые вносят разрывы в цепи строго друг против друга с образованием фрагментов ДНК с «тупыми» концами.

Для осуществления модификаций в геноме микроорганизма недостаточно одних только ферментов рестрикции. Во-первых, водородные связи между теми четырьмя основаниями, которые образуют липкие концы, недостаточно прочны, чтобы удержать два объединившихся фрагмента ДНК. Необходим какой-то инструмент для устранения разрыва в сахарофосфатном остове молекулы. Таким инструментом является ДНК-лигаза бактериофага Т4. Этот фермент катализирует образование фосфодиэфирных связей между концами полинуклеотидных цепей, которые уже удерживаются вместе благодаря спариванию липких концов. Кроме того, ДНК-лигаза Т4 «сшивает» тупые концы, которые сближаются друг с другом после того, как объединяемые фрагменты связываются с ферментом. Во-вторых, объединение разных молекул ДНК само по себе бесполезно, если вновь образованные комбинации (рекомбинантные ДНК) не будут реплицироваться в клетке-хозяине. Таким образом, если одна масть рекомбинантной молекулы ДНК несет нужный ген, который предполагается клонировать, то другая должна содержать информацию, необходимую для репликации в клетке рекомбинантной ДНК. Чтобы решить эту проблему, используют клонирующие векторы. В-третьих, при рестрикции ДНК образуется смесь разнообразных фрагментов, и после их легирования с векторной ДНК образуется множество различных комбинаций. Необходимо уметь распознавать тереципиентные клетки, которые содержат ДНК с нужной нуклеотидной последовательностью.

2. Вектор

Вектор (в генетике) - молекула нуклеиновой кислоты, чаще всего ДНК, используемая в генетической инженерии для передачи генетического материала другой клетке.

Существующие векторы:

* плазмиды

* вектор на основе бактериофага

* векторы на основе вирусов эукариотических организмов

2.1 Плазмиды

Многие свойства бактерий, интересные с точки зрения биотехнологии, кодируются плазмидами. Плазмиды-это кольцевые молекулы ДНК, которые стабильно передаются потомству бактериальных клеток независимо от хромосомной ДНК. В генетической инженерии плазмиды используются для клонирования нужных генов.

Плазмиды различаются по молекулярной массе, так самые мелкие плазмиды кодируют один-два белка среднего размера, тогда как более крупные - 300 или более белков. Крупные плазмиды могут кодировать множество ферментов, необходимых для работы целой последовательности биохимических реакций, например для превращения толуола в катехол.

В бактериальных клетках плазмиды существуют в виде кольцевых двухцепочечных ДНК, которые, кроме того, находятся в св...